RIOK1相分離通過(guò)應(yīng)激顆粒激活肝癌腫瘤生長(zhǎng)限制PTEN翻譯

   對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的耐藥性削弱了其在肝細(xì)胞癌（HCC）中的臨床療效。通過(guò)相分離形成的應(yīng)激顆粒對(duì)應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要，并且可能參與治療耐藥性，但其在肝細(xì)胞癌中的機(jī)制尚不清楚。作者的篩選結(jié)果顯示，非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶RIOK1在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，與預(yù)后不良相關(guān)，并且在多種應(yīng)激條件下通過(guò)NRF2轉(zhuǎn)錄激活。RIOK1通過(guò)將IGF2BP1和G3BP1整合到應(yīng)激顆粒中發(fā)生液 - 液相分離，這些應(yīng)激顆?？筛綦xPTEN信使RNA，從而減少其翻譯。這一過(guò)程激活了磷酸戊糖途徑，有助于應(yīng)激解除和對(duì)TKI的細(xì)胞保護(hù)。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑西達(dá)本胺（chidamide）可下調(diào)RIOK1，并增強(qiáng)TKI的療效。在對(duì)多納非尼耐藥的肝細(xì)胞癌患者腫瘤中發(fā)現(xiàn)了RIOK1陽(yáng)性的應(yīng)激顆粒?？傊?，作者的研究示了應(yīng)激顆粒動(dòng)態(tài)變化、代謝重編程與肝細(xì)胞癌進(jìn)展之間的聯(lián)系，為提高TKI的療效提供了潛在手段。該研究于2025年6月發(fā)表在《Nature Cancer》，IF 28.5分。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、RIOK1高表達(dá)與肝細(xì)胞癌（HCC）進(jìn)展相關(guān)

   為了識(shí)別肝細(xì)胞癌（HCC）中與生死命運(yùn)相關(guān)的應(yīng)激標(biāo)志物，特別是激酶相關(guān)基因，作者重新分析了Tarumoto及其同事進(jìn)行的以激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)橹攸c(diǎn)的CRISPR篩選，以提取HCC特異性候選基因（圖1a）。了識(shí)別適應(yīng)性反應(yīng)蛋白作為特定的脆弱點(diǎn)，作者對(duì)在谷氨酰胺（GLN）剝奪條件下HCC細(xì)胞中上調(diào)的激酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，模擬肝臟腫瘤的低谷氨酰胺微環(huán)境（圖1b）。這些數(shù)據(jù)的交集確定了RIOK1為僅有的候選基因（圖1c、d），這促使作者研究其在HCC中的作用以及與患者預(yù)后的相關(guān)性。

   值得注意的是，作者證實(shí)了RIOK1在HCC中與鄰近組織相比具有顯著更高的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖1e-g）。通過(guò)對(duì)涉及HCC腫瘤的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析，作者發(fā)現(xiàn)RIOK1與谷氨酰胺代謝相關(guān)基因表現(xiàn)出互斥的空間表達(dá)模。此外，作者進(jìn)一步調(diào)查了來(lái)自國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟（ICGC）和NCBI基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)的另外九個(gè)公開(kāi)可用的HCC數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步驗(yàn)證了RIOK1 mRNA在HCC中的差異性上。在TCGA數(shù)據(jù)集中，根據(jù)RIOK1腫瘤表達(dá)水平對(duì)HCC患者進(jìn)行分層顯示，高表達(dá)與更差的總生存率和無(wú)病生存率密切相。接下來(lái)，作者繼續(xù)探索RIOK1在HCC細(xì)胞系模型中的功能。

   對(duì)HCC細(xì)胞系中的mRNA和蛋白水平進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞中的RIOK1表達(dá)水平高于SNU449和PLC/RNF/5細(xì)。因此，作者使用shRNA靶向HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞中的RIOK1，同時(shí)在SNU449和PLC/RNF/5細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定的RIOK1過(guò)表達(dá)。然后，作者使用CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估了RIOK1操作后的生長(zhǎng)表型。通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立序列進(jìn)行的RIOK1敲低減少了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，而強(qiáng)制RIOK1上調(diào)則增強(qiáng)了增殖（圖1h-l）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果，RIOK1敲低的HCCLM3細(xì)胞的皮下異種移植物比對(duì)照組生長(zhǎng)得更慢（圖1m、n）。因此，RIOK1的表達(dá)與體外和體內(nèi)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)，盡管其機(jī)制尚未明確。

   關(guān)于RIOK1敲低如何影響HCC細(xì)胞增殖的一個(gè)線索是誘導(dǎo)了“荷包蛋”細(xì)胞表型，暗示了細(xì)胞衰老。事實(shí)上，SA-β-半乳糖苷酶染色顯示，在RIOK1敲低后，衰老細(xì)胞明顯增多，并伴隨著γ-H2AX焦點(diǎn)的積累，表明與衰老相關(guān)的異染色質(zhì)焦點(diǎn)（圖1o-q）。通過(guò)比較RNA-seq和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析發(fā)現(xiàn)，RIOK1敲低所改變的基因與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)，表明該通路是RIOK1的下游通路。對(duì)關(guān)鍵調(diào)控和衰老檢查點(diǎn)標(biāo)記物的分析顯示，在RIOK1敲低后，PTEN、p21、p27和γ-H2AX蛋白水平升高，而RIOK1過(guò)表達(dá)則降低了這些蛋白水。值得注意的是，RIOK1操作后PTEN mRNA水平保持不變，而p21和p27的轉(zhuǎn)錄水平與其蛋白變化一。進(jìn)一步值得注意的是，沉默RIOK1抑制了PTEN下游信號(hào)傳導(dǎo)，顯著降低了Akt-Thr308、p70S6K和4E-BP1的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，高RIOK1表達(dá)可能促進(jìn)HCC的進(jìn)展。

圖1：RIOK1是與HCC進(jìn)展相關(guān)的激酶相關(guān)基因

2、RIOK1通過(guò)IGF2BP1-G3BP1相互作用驅(qū)動(dòng)應(yīng)激顆粒（SGs）的組裝

   為了闡明RIOK1的功能，作者通過(guò)免疫沉淀（IP）質(zhì)譜（MS）在HCCLM3細(xì)胞中鑒定其結(jié)合伙伴。一個(gè)顯著的共沉淀帶與G3BP1和IGF2BP1匹配，這些分別的關(guān)聯(lián)通過(guò)Western blotting和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)與Flag-RIOK1和HA標(biāo)記的構(gòu)建體得到確認(rèn)（圖2a-d）。RIOK1是一種缺乏激活環(huán)和底物識(shí)別位點(diǎn)的非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶，盡管其激酶活性與細(xì)胞周期進(jìn)展和核糖體生物發(fā)生有關(guān)。作者假設(shè)RIOK1可能影響G3BP1或IGF2BP1的磷酸化。Phos-tag SDS凝膠實(shí)驗(yàn)顯示，RIOK1過(guò)表達(dá)降低了IGF2BP1的磷酸化水平，而RIOK1敲低則增加了其磷酸化水平，盡管對(duì)G3BP1的磷酸化沒(méi)有影響（圖2e、f）。此外，體外下拉實(shí)驗(yàn)顯示RIOK1直接與IGF2BP1結(jié)合，但不與G3BP1結(jié)合，表明有一個(gè)中間蛋白介導(dǎo)了RIOK1-G3BP1的相互作用（圖2g、h）。為了確定RIOK1與IGF2BP1相互作用所需的區(qū)域，作者使用兩種蛋白的截短形式進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域繪圖實(shí)驗(yàn)。分析顯示，RIOK1的羧基末端區(qū)域（480-568氨基酸）與IGF2BP1結(jié)合，而IGF2BP1的中部區(qū)域（345-577氨基酸）介導(dǎo)了其與RIOK1的相互作用（圖2i、）。

   然后，作者重新考慮了RIOK1和IGF2BP1磷酸化之間的關(guān)系。在SNU449細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RIOK1的激酶區(qū)域并未改變IGF2BP1的磷酸化狀。相應(yīng)地，共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，RIOK1過(guò)表達(dá)并未影響IGF2BP1的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，而是降低了其酪氨酸磷酸化水平（圖2k），這意味著RIOK1以激酶獨(dú)立的方式影響IGF2BP1的磷酸化。作者注意到一個(gè)可能的類比，即IGF2BP1的RNA結(jié)合活性需要SRC介導(dǎo)的酪氨酸396磷酸化，而且，阻止Tyr396磷酸化會(huì)導(dǎo)致IGF2BP1被隔離到細(xì)胞質(zhì)顆粒中，并伴隨著其客戶轉(zhuǎn)錄本的翻譯沉默。因此，作者推測(cè)RIOK1-IGF2BP1的相互作用旨在抑制IGF2BP1中Tyr396的磷酸化水平，并隨之形成依賴IGF2BP1的顆粒。因此，作者使用免疫熒光染色檢查了RIOK1表達(dá)如何影響IGF2BP1的細(xì)胞分布。值得注意的是，異位RIOK1被觀察到與IGF2BP1共聚在類似于應(yīng)激顆粒（SGs）的結(jié)構(gòu)中（圖2l）。

   與此同時(shí)，作者檢查了G3BP1，它本身是SG組裝的核心節(jié)點(diǎn)，并與IGF2BP1合作形成RNA-蛋白（RNP）顆粒，觀察到在過(guò)表達(dá)RIOK1的細(xì)胞中，IGF2BP1和G3BP1在類似SG的焦點(diǎn)中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的共染色（圖2m-）。值得注意的是，這些結(jié)構(gòu)在已知可解聚SGs的CHX處理后分散，并且時(shí)間延遲成像顯示，共表達(dá)G3BP1的RIOK1誘導(dǎo)的顆粒持續(xù)了數(shù)天（圖2p-r）。相反，在arsenate刺激下，RIOK1敲低減少了它們的動(dòng)態(tài)組。這些結(jié)果共同表明，RIOK1對(duì)于IGF2BP1和G3BP1建立SGs很重要，也表明G3BP1通過(guò)IGF2BP1與RIOK1相關(guān)聯(lián)。支持后者的概念，兩步免疫沉淀的結(jié)果顯示，當(dāng)與HA-IGF2BP1共表達(dá)時(shí)，內(nèi)源性G3BP1在第一階段與Flag-RIOK1的免疫沉淀中更強(qiáng)烈地被回收。在用Flag肽洗脫后，針對(duì)HA的第二階段免疫沉淀確認(rèn)了Flag-RIOK1、HA-IGFBP1和G3BP1作為一個(gè)三元復(fù)合體存在（圖2s）。綜合這些結(jié)果表明，RIOK1影響IGF2BP1中的調(diào)控磷酸化事件，調(diào)節(jié)由IGF2BP1和G3BP1形成的RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的動(dòng)態(tài)。

圖2：RIOK1促進(jìn)IGF2BP1和G3BP1之間的相互作用以增強(qiáng)SG組裝

3、RIOK1在體內(nèi)和體外均發(fā)生液 - 液相分離（LLPS）

   液 - 液相分離可以通過(guò)核酸蛋白中的內(nèi)在無(wú)序區(qū)域（IDRs）來(lái)促進(jìn)。利用PONDR，作者在RIOK1的C末端檢測(cè)到了IDRs，這些區(qū)域可能有助于相變事件的發(fā)生（圖3a）。為了驗(yàn)證這一概念，作者將RIOK1-IDR與擬南芥Cry2蛋白的光解酶同源區(qū)進(jìn)行了融合，Cry2蛋白在暴露于藍(lán)光時(shí)會(huì)發(fā)生自我聚集。值得注意的是，RIOK1-IDR-Cry2融合蛋白表現(xiàn)出快速的藍(lán)光依賴性聚集（圖3b）。此外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刪除IDR（ΔIDR-RIOK1）后，異位表達(dá)RIOK1-綠色熒光蛋白（GFP）的細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)液滴的形成被消除（圖3c、d）。

   液 - 液相分離結(jié)構(gòu)具有流動(dòng)性，能夠融合、分散，并允許液相內(nèi)的分子移動(dòng)。事實(shí)上，較小的RIOK1-GFP液滴傾向于聚合成較大的結(jié)構(gòu)，而較大的液滴則會(huì)分裂成較小的液滴（圖3e）。對(duì)細(xì)胞內(nèi)RIOK1-GFP液滴進(jìn)行光漂白后熒光恢復(fù)（FRAP）成像顯示，在漂白區(qū)域大約30秒后熒光恢復(fù)（圖3f），這表明RIOK1是移動(dòng)相的一部分。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)在體外，重組RIOK1-GFP在聚乙二醇8000存在的情況下以及獨(dú)立地以濃度依賴的方式形成了液滴（圖3g、h）。此外，這些液滴隨著時(shí)間的推移被觀察到融合，F(xiàn)RAP成像顯示漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)迅速，這表明在液相中發(fā)生了動(dòng)態(tài)交換事件（圖3i - k）。因此，RIOK1本質(zhì)上會(huì)發(fā)生液 - 液相分離。

   為了將RIOK1與應(yīng)激顆粒（SGs）/RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的形成與其與IGF2BP1的相互作用聯(lián)系起來(lái)，作者進(jìn)行了體外相分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)純化的RIOK1-GFP和IGF2BP1-BFP能夠被整合到可融合的液滴中（圖3l）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，與ΔIDR-RIOK1-GFP相比，RIOK1-GFP增強(qiáng)了IGF2BP1進(jìn)入顆粒的能力，而ΔIDR-RIOK1則無(wú)法促進(jìn)IGF2BP1的相變（圖3m）。值得注意的是，ΔIDR-RIOK1還顯示出抑制IGF2BP1酪氨酸磷酸化的能力降低，這將IGF2BP1的磷酸化與RIOK1介導(dǎo)的LLPS聯(lián)系起來(lái)（圖3n）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，異位表達(dá)的RIOK-GFP、IGF2BP1-BFP和G3BP1-mCherry能夠在細(xì)胞內(nèi)的類似SGs的結(jié)構(gòu)中共表達(dá)，同時(shí)重組蛋白混合物也能夠在體外形成可融合的結(jié)構(gòu)。因此，作者的綜合發(fā)現(xiàn)表明，RIOK1介導(dǎo)的LLPS與IGF2BP1和G3BP1協(xié)同促進(jìn)顆粒的形成。

圖3：RIOK1通過(guò)其羧基末端IDR區(qū)經(jīng)歷LLPS

4、RIOK1的LLPS抑制PTEN的翻譯

   在明確了RIOK1-IGF2BP1-G3BP1復(fù)合體之后，作者對(duì)其生理相關(guān)性進(jìn)行了研究。鑒于IGF2BP1能夠穩(wěn)定PTEN mRNA的證據(jù)以及作者發(fā)現(xiàn)的RIOK1驅(qū)動(dòng)的PTEN mRNA翻譯阻斷，作者假設(shè)RIOK1介導(dǎo)的與IGF2BP1/G3BP1的應(yīng)激顆粒（SG）形成調(diào)控了PTEN的翻譯狀態(tài)。支持這一假設(shè)的是，在確認(rèn)了PTEN mRNA smFISH探針的有效性之后，全長(zhǎng)RIOK1的過(guò)表達(dá)（而非ΔIDR-RIOK1突變體）促使PTEN mRNA聚合成IGF2BP1/G3BP1顆粒（圖4a - c。在對(duì)照組或ΔIDR-RIOK1細(xì)胞中，PTEN mRNA和蛋白水平保持不變，而全長(zhǎng)RIOK1則降低了PTEN蛋白水平（圖4d、e）。

   為了更好地定義PTEN mRNA與SG成分之間的復(fù)合體，作者在表達(dá)HA-IGF2BP1的細(xì)胞中進(jìn)行了兩步免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞分別表達(dá)Flag-空載體（EV）、Flag-RIOK1或Flag-ΔIDR-RIOK1構(gòu)建體。第一階段使用抗HA抗體的免疫沉淀表明，完整的RIOK1對(duì)于富集PTEN mRNA的回收至關(guān)重要。第二階段針對(duì)G3BP1的免疫沉淀證實(shí)，HA-IGF2BP1、G3BP1、Flag-RIOK1和PTEN mRNA形成了四元復(fù)合體（圖4f），這很可能代表了完整細(xì)胞中觀察到的SGs。利用純化的GFP-RIOK1、IGF2BP1-BFP和熒光標(biāo)記的PTEN mRNA進(jìn)行的相分離實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，全長(zhǎng)RIOK1（而非ΔIDR-RIOK1-GFP突變體）增強(qiáng)了含有PTEN mRNA的IGF2BP1液滴的形成（圖4g），這表明RIOK1介導(dǎo)的LLPS促進(jìn)了PTEN mRNA被隔離到SGs中。

   多聚體分析實(shí)驗(yàn)正式確立了RIOK1與PTEN翻譯調(diào)控之間的聯(lián)系。盡管RIOK1的過(guò)表達(dá)微妙地促進(jìn)了多聚體的組裝，但含有PTEN mRNA的延伸多聚體數(shù)量減少，這表明RIOK1通過(guò)LLPS劫持PTEN mRNA暫停了其翻譯（圖4h、i）。支持這一觀點(diǎn)的是，在SNU449細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染與G3BP1無(wú)關(guān)的GFP-“合成”構(gòu)建體來(lái)模擬合成SG的形成。該構(gòu)建體在氧化應(yīng)激下恢復(fù)了G3BP1/2敲低細(xì)胞中的SG形成（圖4j - m）。在G3BP1敲低細(xì)胞中共同表達(dá)RIOK1和GFP-“合成”構(gòu)建體能夠在正常條件下誘導(dǎo)SG形成，富集SGs中的PTEN mRNA并降低PTEN表達(dá)（圖4n - q）。這些結(jié)果共同將RIOK1介導(dǎo)的SGs與PTEN mRNA的翻譯抑制因果聯(lián)系起來(lái)。

   接下來(lái)，作者研究了RIOK1、IGF2BP1酪氨酸磷酸化和通過(guò)LLPS隔離PTEN mRNA之間的聯(lián)系。事實(shí)上，ΔIDR-RIOK1突變體無(wú)法抑制IGF2BP1酪氨酸磷酸化以及無(wú)法參與LLPS，這暗示了這兩種活性在調(diào)控PTEN翻譯中的重要性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者構(gòu)建了一個(gè)磷酸化抗性IGF2BP1（Y396A）突變體。正如預(yù)期的那樣，RIOK1的過(guò)表達(dá)降低了與野生型IGF2BP1共表達(dá)的細(xì)胞中的PTEN蛋白水平，但并未降低與Y396A突變體共表達(dá)的細(xì)胞中的PTEN蛋白水平（圖4r）?？梢暬瘜?shí)驗(yàn)表明，RIOK1增強(qiáng)了含有IGF2BP1、G3BP1和PTEN mRNA的類似SG的結(jié)構(gòu)，但這種增強(qiáng)僅在野生型IGF2BP1存在時(shí)出現(xiàn)，而非突變體（圖4s - u）。多聚體分析證實(shí)，RIOK1介導(dǎo)的PTEN mRNA翻譯抑制在表達(dá)突變型IGF2BP1的細(xì)胞中被消除（圖4v、w）。此外，IGF2BP1的沉默減輕了RIOK1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中PTEN的下調(diào)（圖4x）。這些觀察結(jié)果共同確立了RIOK1介導(dǎo)的LLPS、SG聚集與PTEN翻譯抑制之間的直接聯(lián)系。

圖4：RIOK1 LLPS通過(guò)SGs劫持PTEN mRNA抑制PTEN翻譯

5、RIOK1驅(qū)動(dòng)PPP并被NRF2轉(zhuǎn)錄激活

   PTEN的缺失已知通過(guò)穩(wěn)定G6PD來(lái)調(diào)節(jié)PPP和NADPH的產(chǎn)生，G6PD是細(xì)胞增殖和氧化還原平衡的關(guān)鍵酶。相應(yīng)地，非靶向代謝組學(xué)揭示了在RIOK1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中PPP相關(guān)代謝物顯著增加以及NADP+/NADPH比率降低，而在RIOK1耗盡的細(xì)胞中則觀察到相反的效果（圖5a - c）。尼羅紅染色證實(shí)了RIOK1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的脂質(zhì)積累增加（圖5d）。應(yīng)激顆粒（SGs）作為一種關(guān)鍵的泛應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制在腫瘤發(fā)生中的作用也越來(lái)越受到認(rèn)可。作者接下來(lái)利用通過(guò)Cre-lox技術(shù)生成的肝臟特異性RIOK1條件性敲除（cKO）小鼠來(lái)研究其對(duì)腫瘤起始和進(jìn)展的影響。通過(guò)水動(dòng)力尾靜脈注射編碼MycOE和Trp53KO質(zhì)粒的Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座酶載體，在RIOK1 cKO（Riok1ΔAlb）小鼠中誘導(dǎo)自發(fā)性肝臟腫瘤，同時(shí)以它們的floxed同窩小鼠（Riok1fl/fl）作為對(duì)照?；蛘?，利用二乙基亞硝胺（DEN）/CCL4模型誘導(dǎo)肝臟腫瘤。與促腫瘤作用一致，Riok1ΔAlb小鼠出現(xiàn)了較小的肝臟病變，肝臟/體重比降低，腫瘤增殖降低，如Ki67+陽(yáng)性所示（圖5e - i）。在自發(fā)性肝臟腫瘤中RIOK1的缺失降低了SGs中的Pten mRNA，增加了PTEN蛋白和G6PD水平（圖5j - m）。對(duì)Riok1fl/fl和Riok1ΔAlb小鼠肝臟腫瘤的RNA-seq分析顯示，RIOK1與外部刺激和防御反應(yīng)顯著相關(guān)，支持其在應(yīng)激適應(yīng)中的作用。IGF2BP1 Y396A突變體的過(guò)表達(dá)加速了Riok1ΔAlb cKO小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生，并增加了肝臟/體重比，突出了IGF2BP1 Tyr396在RIOK1介導(dǎo)的HCC進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。為了確定應(yīng)激腫瘤細(xì)胞中RIOK1上調(diào)的機(jī)制，作者使用JASPAR分析其啟動(dòng)子，識(shí)別出兩個(gè)高評(píng)分的NRF2結(jié)合位點(diǎn)（-218/-228和-1169/-1179）。

   提示性地，作者在TCGA HCC數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)NRF2和RIOK1 mRNA水平之間存在正相關(guān)（圖5n）。指導(dǎo)性地，作者觀察到NRF2過(guò)表達(dá)增加了RIOK1 mRNA和蛋白水平，而NRF2敲低則降低了它們（圖5o - q）。ChIP實(shí)驗(yàn)確認(rèn)NRF2結(jié)合到近端-218/-228位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示RIOK1啟動(dòng)子對(duì)NRF2過(guò)表達(dá)有反應(yīng)，且在位點(diǎn)1突變后活性消失（圖5r - t）。先前的研究強(qiáng)調(diào)了在谷氨酰胺（GLN）匱乏期間NRF2的激活。在GLN匱乏的細(xì)胞中，RIOK1表達(dá)隨時(shí)間增加，與NRF2升高和PTEN降低同時(shí)發(fā)生，而NRF2沉默則在相同條件下降低了RIOK1表達(dá)（圖5u、v）。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明NRF2參與HCC進(jìn)展和治療抵抗，例如逃避TKIs的效果。類似于GLN/葡萄糖匱乏反應(yīng)，缺氧以及索拉非尼和多納非尼治療增加了HCC細(xì)胞中NRF2和RIOK1的表達(dá)，同時(shí)抑制了PTEN表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，NRF2驅(qū)動(dòng)的RIOK1轉(zhuǎn)錄激活是HCC細(xì)胞應(yīng)對(duì)不利刺激的普遍適應(yīng)性機(jī)制，盡管LLPS是否是常見(jiàn)的下游機(jī)制仍有待探索。

圖5：RIOK1驅(qū)動(dòng)PPP并被NRF2反激活

6、RIOK1誘導(dǎo)的LLPS削弱了HCC對(duì)TKIs的敏感性

   作者進(jìn)一步研究了 RIOK1 介導(dǎo)的液-液相分離（LLPS）和應(yīng)激顆粒（SG）形成是否是一種普遍的適應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致 PTEN 的抑制。在缺乏谷氨酰胺（GLN）或接受索拉非尼（sorafenib）和多納非尼（donafenib）處理的 HCCLM3 細(xì)胞中，出現(xiàn)了包含 RIOK1/G3BP1/PTEN mRNA 的 SG 樣結(jié)構(gòu)（圖 6a–c）。相反，在上述條件下沉默 RIOK1 會(huì)破壞 IGF2BP1–G3BP1 的相互作用以及 SG 的形成，而 RIOK1 的過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)了對(duì)多納非尼誘導(dǎo)的 SG 形成（圖 6d–f），這表明 RIOK1 介導(dǎo)的 SG 形成是對(duì)這些應(yīng)激刺激的共同反應(yīng)機(jī)制。

   RIOK1 下游的表現(xiàn)也顯示出類似的規(guī)律。在多納非尼處理的細(xì)胞中，RIOK1 的過(guò)表達(dá)降低了 PTEN 的表達(dá)，增加了 G6PD 的表達(dá)，從而減緩了通常由應(yīng)激引起的 NADP+/NADPH 比例升高（圖 6g,h）。這種代謝平衡的恢復(fù)促進(jìn)了細(xì)胞活力，說(shuō)明 RIOK1 有助于細(xì)胞應(yīng)對(duì)多納非尼誘導(dǎo)的應(yīng)激（圖 6i）。與之相符的是，野生型 RIOK1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞在接受索拉非尼或多納非尼處理后，其細(xì)胞死亡比例顯著低于表達(dá)ΔIDR–RIOK1 突變體的細(xì)胞（圖 6j）。相反，沉默 RIOK1 會(huì)保持 PTEN 表達(dá)、抑制 G6PD 的誘導(dǎo)，這增強(qiáng)了氧化應(yīng)激、降低了細(xì)胞活性，并加劇了 TKI 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖 6k–o）。同樣，在 GLN 缺乏條件下，RIOK1 的過(guò)表達(dá)提高了細(xì)胞的存活率，而其敲低則增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)缺 GLN 處理的敏感性。此外，與 PPP（磷酸戊糖途徑）在 TKI 應(yīng)答中的關(guān)鍵作用一致，使用 G6PDi-1（一種可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性 G6PD 抑制劑）可逆轉(zhuǎn) RIOK1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞對(duì)多納非尼誘導(dǎo)死亡的抗性（圖 6p）。同時(shí)，通過(guò) 2DG 激活 PPP 可恢復(fù) RIOK1 敲低細(xì)胞在多納非尼處理下的活力（圖 6q）。這些結(jié)果表明，RIOK1 通過(guò)激活 PPP 來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受 TKI 誘導(dǎo)的死亡。

   為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些觀察結(jié)果，作者使用了 HCCLM3 細(xì)胞的小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)。敲低 RIOK1 的腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組，而 RIOK1 敲低聯(lián)合多納非尼處理則顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)（圖 6r,s）。針對(duì) Ki67 的免疫組化染色顯示，在 RIOK1 敲低并接受多納非尼處理的腫瘤中，增殖活性降低。綜上所述，這些結(jié)果確立了 RIOK1 驅(qū)動(dòng)的 LLPS 和 PTEN 抑制是 TKI 抵抗的核心機(jī)制，促進(jìn)了 HCC 在體內(nèi)外環(huán)境中的生存與治療耐受。

圖6：RIOK1消融增強(qiáng)了TKI的抗癌活性

7、西達(dá)本胺靶向RIOK1以增強(qiáng)TKI治療效果

   作者的研究結(jié)果將RIOK1提議為HCC的治療靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者利用計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)了RIOK1結(jié)構(gòu)（PDB ID 6ZXG，包括潛在的泛素化位點(diǎn)K190）與FDA批準(zhǔn)藥物庫(kù)中的1806種化合物之間的結(jié)合情況（圖7a）。根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)，確定的前八種候選化合物是布雷哌唑、去氧膽酸、regorafenib、pexidartinib、多奈哌齊、ruxolitinib、西達(dá)本胺和羅格列酮（圖7b - e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a）。對(duì)這八種化合物進(jìn)行初步測(cè)試發(fā)現(xiàn)，只有西達(dá)本胺能夠顯著降低HCC細(xì)胞中RIOK1蛋白水平（圖7f）。表面等離子共振（SPR）證實(shí)西達(dá)本胺與RIOK1具有高親和力結(jié)合（Kd = 22.89μM；圖7g），細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示西達(dá)本胺在低微摩爾濃度下誘導(dǎo)RIOK1水平的劑量依賴性降低，這可能是由于RIOK1的多泛素化和蛋白酶體降解所致（圖7h - i）。此外，西達(dá)本胺顯著降低了高RIOK1表達(dá)的患者來(lái)源異種移植（PDX）腫瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)低RIOK1表達(dá)的腫瘤無(wú)影響，表明西達(dá)本胺在體內(nèi)的靶向療效（圖7j、k和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6b）。此外，與RIOK1敲低類似，西達(dá)本胺抑制了HCC細(xì)胞對(duì)多納非尼的RIOK1誘導(dǎo)反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)了PTEN下調(diào)和G6PD穩(wěn)定化（圖7m）。

   為了進(jìn)一步評(píng)估西達(dá)本胺的有效性，作者測(cè)試了其單獨(dú)使用以及與多種TKIs在HCC模型中的效果。集落形成和細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明，西達(dá)本胺抑制了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，并進(jìn)一步增強(qiáng)了TKIs（包括多納非尼、侖伐替尼、索拉非尼和regorafenib）的抗腫瘤效果（圖7n）。聯(lián)合指數(shù)分析證實(shí)了西達(dá)本胺與TKI治療之間的協(xié)同作用，尤其是在長(zhǎng)時(shí)間暴露的情況下。此外，西達(dá)本胺增強(qiáng)了多納非尼對(duì)HCC患者來(lái)源類器官（PDOs）的生長(zhǎng)抑制效果（圖7o、p）。

   作者將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到體內(nèi)模型，在PDX和同種異體小鼠Hep1-6 HCC模型中聯(lián)合使用西達(dá)本胺和多納非尼，并在SgP53/Myc自發(fā)性肝臟腫瘤模型中評(píng)估生存率。西達(dá)本胺單獨(dú)使用可減少PDX和Hep1-6模型中的腫瘤生長(zhǎng)，但聯(lián)合治療顯示出更大的療效，并顯著提高了攜帶自發(fā)性肝臟腫瘤小鼠的生存率（圖7q - u）。治療過(guò)程耐受性良好，僅觀察到適度的體重減輕。這些結(jié)果突出了靶向RIOK1可以使HCC細(xì)胞對(duì)TKIs敏感化。

圖7：Chidamide靶向RIOK1，協(xié)同TKI治療效果

8、RIOK1 與 TKI 耐藥及不良預(yù)后相關(guān)

   作者的初步研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌（HCC）中，RIOK1 的高表達(dá)與更差的臨床結(jié)局相關(guān)。為了在患者中驗(yàn)證這一機(jī)制，作者比較了正常肝組織與 HCC 組織中 RIOK1 的表達(dá)水平以及應(yīng)激顆粒（SG）的出現(xiàn)情況。結(jié)果顯示，在腫瘤組織中，共表達(dá) RIOK1 和 G3BP1 的 SG 樣結(jié)構(gòu)大量存在，而在正常肝細(xì)胞中則極為罕見(jiàn)（圖 8a,b）。

   此外，對(duì) HCC 組織的免疫組織化學(xué)（IHC）分析顯示，RIOK1 的表達(dá)水平與 NRF2 和 G6PD 呈正相關(guān)，與 PTEN 呈負(fù)相關(guān)（圖 8c–f），這與作者此前實(shí)驗(yàn)揭示的調(diào)控機(jī)制一致。作者進(jìn)一步分析了高風(fēng)險(xiǎn)HCC 患者在術(shù)后接受多納非尼輔助治療時(shí)，RIOK1 表達(dá)水平與 TKI 應(yīng)答之間的關(guān)系（圖 8g）。多重免疫熒光成像結(jié)果顯示，在接受多納非尼治療的患者中，原發(fā)腫瘤組織中不敏感腫瘤的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)中 RIOK1 表達(dá)更高，G6PD 水平也更高，相比之下，對(duì)多納非尼敏感的腫瘤則較低（圖 8h–k）。

   進(jìn)一步分析表明，RIOK1 高表達(dá)的患者無(wú)論在總體生存期還是無(wú)進(jìn)展生存期方面均明顯低于 RIOK1 低表達(dá)的患者（圖 8l,m）。這些發(fā)現(xiàn)表明，RIOK1–SG 應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制在臨床 HCC 中是活躍的，并突出了其作為潛在治療靶點(diǎn)的重要性（圖 8n）。

圖8：RIOK1與多納非尼療效負(fù)相關(guān)，與患者預(yù)后差

結(jié)論：

   綜上所述，作者證明了RIOK1 作為 HCC 生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床轉(zhuǎn)化潛力，并確定了 chidamide 作為開(kāi)發(fā)候選藥物的良好先導(dǎo)分子。

參考文獻(xiàn)：

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