Immunity：XBP1缺失破壞黏液屏障，協(xié)同壞死性凋亡惡化結(jié)腸炎

   內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激與壞死性凋亡（necroptosis）在炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)聯(lián)性，但這些通路之間的潛在交互作用尚不明確。本研究顯示，在腸道上皮細(xì)胞（IEC）特異性缺失caspase-8或其銜接蛋白FADD（Fas associated with death domain）的小鼠中，X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的缺失會(huì)顯著加劇壞死性凋亡誘導(dǎo)的結(jié)腸炎（而非回腸炎）的發(fā)展。從機(jī)制上講，XBP1缺失導(dǎo)致結(jié)腸中黏蛋白2（MUC2）表達(dá)減少和黏液層形成受損，使得細(xì)菌能夠穿透并抵達(dá)上皮表面。在上皮單層結(jié)構(gòu)完整的情況下，這并不足以引發(fā)結(jié)腸炎，但與IEC壞死性凋亡協(xié)同作用后會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重結(jié)腸炎癥。我們的研究結(jié)果揭示，XBP1和caspase-8分別調(diào)控腸道屏障的不同組成部分，通過協(xié)同作用維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)并預(yù)防結(jié)腸炎癥。這一發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解IBD的致病機(jī)制。本文于2025年8月發(fā)表于《Immunity》，IF 26.3。

圖形摘要

主要研究結(jié)果

1．XBP1抑制Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠的壞死性凋亡誘導(dǎo)性結(jié)腸炎發(fā)展

   為研究XBP1和caspase-8在IECs中的作用，我們構(gòu)建了Xbp1fl/fl × Vil1-Cre（Xbp1IEC-KO）和Casp8fl/fl × Vil1-Cre（Casp8IEC-KO）小鼠。與既往報(bào)道一致，Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸未出現(xiàn)自發(fā)病理改變，而Casp8IEC-KO小鼠表現(xiàn)出輕度至重度結(jié)腸炎，特征包括增生、輕度上皮侵蝕、IEC死亡及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。為評(píng)估XBP1與caspase-8在調(diào)節(jié)腸上皮穩(wěn)態(tài)中的潛在交互作用，我們構(gòu)建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（IECs中特異性缺失XBP1和caspase-8）。與Casp8IEC-KO及Xbp1fl/fl × Casp8fl/WT × Villin-cretg/WT（Xbp1IEC-KOCasp8IEC-Het）小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠體重顯著減輕（圖1B），表明IECs中XBP1與caspase-8的聯(lián)合缺失導(dǎo)致嚴(yán)重腸道病理改變。組織學(xué)分析顯示，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)腸炎，表現(xiàn)為上皮過度增殖、IEC死亡數(shù)量增加、廣泛上皮侵蝕形成全結(jié)腸散布的潰瘍、黏膜及黏膜下層免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加，以及大量隱窩膿腫形成（圖1A）。組織學(xué)結(jié)腸炎評(píng)分、潰瘍形成及上皮細(xì)胞增殖的量化分析證實(shí)，與Casp8IEC-KO小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結(jié)腸病理惡化程度更高（圖1C–1E）。RNA測(cè)序（RNA-seq）顯示，與Xbp1IEC-KO和Casp8IEC-KO小鼠相比，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結(jié)腸炎癥基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步支持雙基因缺失比單基因缺失導(dǎo)致更嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥（圖1F）。我們前期研究表明，通過RIPK3或MLKL基因缺失抑制壞死性凋亡可阻止Casp8IEC-KO小鼠結(jié)腸炎發(fā)展。因此我們探討：在XBP1介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）與caspase-8信號(hào)聯(lián)合抑制后，壞死性凋亡是否參與加劇結(jié)腸炎。為此，我們構(gòu)建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠。大體觀察、免疫組織學(xué)及RNA-seq分析表明，抑制RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡可完全恢復(fù)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠體重并阻止結(jié)腸炎發(fā)展（圖1A和1C–1G）。IEC特異性缺失FADD的小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎，且嚴(yán)重程度高于Casp8IEC-KO小鼠。與Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的研究結(jié)果一致，并行免疫組織學(xué)評(píng)估與量化分析表明，Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠比FaddIEC-KO小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的結(jié)腸炎。RIPK3缺失同樣阻止了Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。綜上所述，這些結(jié)果表明在上皮細(xì)胞中，XBP1通過抑制壞死性凋亡誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)腸炎，在FaddIEC-KO和Casp8IEC-KO小鼠中發(fā)揮保護(hù)作用。

圖1 IEC特異性XBP1缺失加劇Casp8IEC-KO小鼠的壞死性凋亡誘導(dǎo)性結(jié)腸炎

2．XBP1缺失不會(huì)加劇Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠的回腸炎

   Xbp1IEC-KO小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性回腸炎，表現(xiàn)為上皮增生、潘氏細(xì)胞缺失和黏膜免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，Casp8IEC-KO小鼠會(huì)發(fā)生依賴RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡的自發(fā)性回腸炎。為評(píng)估XBP1與caspase-8聯(lián)合缺失是否也會(huì)加劇回腸炎，我們比較了Xbp1IEC-KO、Casp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的回腸病理。對(duì)Xbp1IEC-KO小鼠回腸切片的溶菌酶免疫染色顯示隱窩中潘氏細(xì)胞數(shù)量減少，這與潘氏細(xì)胞特異性基因（包括溶菌酶Lyz1、Defa5和Defa-rs10）mRNA表達(dá)降低相關(guān)（圖2A和2B）。但我們?cè)赬bp1IEC-KO小鼠回腸中未觀察到CD45免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加（這與既往研究報(bào)道不同），提示遺傳背景和/或微生物群的差異可能影響這些動(dòng)物的小腸病理（圖2A）。與既往報(bào)道一致，Casp8IEC-KO小鼠出現(xiàn)自發(fā)性回腸炎，表現(xiàn)為潘氏細(xì)胞幾乎完全缺失、上皮增生、IEC死亡及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖2A和2B）。Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠也發(fā)生自發(fā)性回腸炎，特征包括上皮增生、潘氏細(xì)胞缺失、IEC死亡及固有層免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A–2D）。并行組織病理學(xué)和基因表達(dá)分析表明，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的小腸病理與Casp8IEC-KO小鼠的回腸炎高度相似（圖2A–2D）。盡管Xbp1IEC-KO小鼠回腸組織學(xué)評(píng)分顯著升高（圖2C），但這主要?dú)w因于該小鼠模型相關(guān)的隱窩增生（圖2D）。此外，Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠的小腸病理也與FaddIEC-KO小鼠的回腸炎高度相似。這些結(jié)果表明，與結(jié)腸中XBP1缺失會(huì)加劇壞死性凋亡誘導(dǎo)的炎癥形成鮮明對(duì)比，IECs中XBP1缺失并未改變Casp8IEC-KO和FaddIEC-KO小鼠回腸炎的嚴(yán)重程度。

圖2 抑制caspase-8介導(dǎo)的凋亡和RIPK3-MLKL誘導(dǎo)的壞死性凋亡不能阻止XBP1缺失所致的潘氏細(xì)胞丟失

3．聯(lián)合抑制凋亡和壞死性凋亡不能阻止Xbp1IEC-KO小鼠的潘氏細(xì)胞丟失

   有觀點(diǎn)認(rèn)為IEC凋亡參與Xbp1IEC-KO小鼠回腸的病理發(fā)展。為探究caspase-8介導(dǎo)的凋亡和RIPK3-MLKL誘導(dǎo)的壞死性凋亡是否導(dǎo)致Xbp1IEC-KO小鼠的上皮增生和潘氏細(xì)胞丟失，我們檢測(cè)了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?動(dòng)物的小腸組織。免疫組織學(xué)與基因表達(dá)分析顯示，RIPK3或MLKL缺失將Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠回腸炎嚴(yán)重程度降低至Xbp1IEC-KO小鼠水平（圖2A–2D）。但Ki67和溶菌酶免疫染色表明，聯(lián)合抑制caspase-8依賴性凋亡和RIPK3-MLKL依賴性壞死性凋亡并不能阻止XBP1缺失誘導(dǎo)的上皮增生和潘氏細(xì)胞丟失——Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠均表現(xiàn)出與Xbp1IEC-KO小鼠相似的小腸病理（圖2A–2D）。與溶菌酶免疫染色結(jié)果一致，定量RT-PCR（RT-qPCR）分析顯示Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠中Lyz1、Defa5和Defa-rs10表達(dá)顯著降低（圖2B）。我們推測(cè)不依賴caspase-8和壞死性凋亡的細(xì)胞死亡可能參與XBP1缺失誘導(dǎo)的潘氏細(xì)胞丟失和上皮增生。因此我們對(duì)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠回腸切片進(jìn)行cleaved caspase-3（CC3）和TUNEL染色。這些實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)Xbp1IEC-KO、Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠隱窩內(nèi)死亡IECs數(shù)量較對(duì)照組增加。與既往發(fā)現(xiàn)一致，我們檢測(cè)到Xbp1IEC-KOFaddIEC-KORipk3?/?小鼠回腸中CC3和TUNEL陽性IECs數(shù)量較對(duì)照組增加。這些結(jié)果表明FADD-caspase-8依賴性凋亡和RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡不驅(qū)動(dòng)Xbp1IEC-KO小鼠的潘氏細(xì)胞丟失和上皮增生。

4．上皮細(xì)胞固有的TNFR1信號(hào)驅(qū)動(dòng)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎惡化

   IEC特異性腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）缺失可減輕Casp8IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎發(fā)展。TNFR1也參與Xbp1IEC-KO小鼠回腸炎的發(fā)展。為探究IECs中TNFR1信號(hào)是否介導(dǎo)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的嚴(yán)重結(jié)腸炎，我們構(gòu)建并分析了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfr1IEC-KO小鼠。免疫組織學(xué)評(píng)估和RNA-seq分析顯示，上皮TNFR1缺失強(qiáng)烈抑制了Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfr1IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎發(fā)展（圖3A–3E）。有觀點(diǎn)認(rèn)為，XBP1缺失的IECs和/或潘氏細(xì)胞中核因子κB（NF-κB）激活可能驅(qū)動(dòng)腫瘤壞死因子（TNF）產(chǎn)生，從而參與Xbp1IEC-KO小鼠的腸炎發(fā)生。因此我們推測(cè)IEC來源的TNF水平升高可能加劇Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎。為驗(yàn)證該假設(shè)，我們構(gòu)建并分析了IECs中特異性缺失XBP1、caspase-8和TNF的Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfIEC-KO小鼠。結(jié)腸切片免疫組織學(xué)分析表明，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOTnfIEC-KO小鼠發(fā)生的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度與Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠相似（圖3A–3D），排除了IEC來源的TNF在驅(qū)動(dòng)該病理中的作用。此外，IEC特異性缺失TNF或TNFR1并未緩解Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的潘氏細(xì)胞丟失和小腸病理。這些結(jié)果與我們之前的發(fā)現(xiàn)一致：TNFR1在Casp8IEC-KO小鼠壞死性凋亡驅(qū)動(dòng)的小腸炎癥中不起重要作用。綜上結(jié)果表明，上皮細(xì)胞固有的TNFR1信號(hào)驅(qū)動(dòng)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎惡化，但I(xiàn)EC來源的TNF并不起重要作用。

圖3 IECs中TNFR1信號(hào)加重Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度

5．IEC特異性XBP1缺失損害結(jié)腸黏液層形成

   RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示，Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸中僅有的顯著減少的轉(zhuǎn)錄本是Muc2（圖4A）。RT-qPCR分析、免疫染色及特異性抗體免疫印跡均證實(shí)，與對(duì)照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸中MUC2 mRNA和蛋白表達(dá)降低（圖4B）。Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量未減少，但細(xì)胞體積較小且MUC2表達(dá)降低。MUC2是腸道中最豐富的凝膠形成型黏蛋白，也是黏液層的主要組成部分。阿爾新藍(lán)- PAS（AB-PAS）染色顯示，與同窩對(duì)照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸黏蛋白水平降低。RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，其他黏液相關(guān)基因在Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸中未見顯著改變。MUC2是結(jié)腸上皮表面不可穿透黏液層的關(guān)鍵組分，能阻止管腔細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞接觸。我們推測(cè)IEC特異性XBP1缺失導(dǎo)致的Muc2表達(dá)減少可能損害黏液層形成，使得更多細(xì)菌接觸上皮，從而加劇Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOFaddIEC-KO小鼠的結(jié)腸炎發(fā)展。為研究MUC2產(chǎn)生減少是否會(huì)破壞Xbp1IEC-KO小鼠保護(hù)性黏液層的形成，我們檢測(cè)了用卡諾固定液（可保留黏液結(jié)構(gòu)）固定的含糞便物質(zhì)遠(yuǎn)端結(jié)腸組織切片。AB-PAS染色及MUC2免疫染色顯示對(duì)照組小鼠結(jié)腸存在完整厚黏液層（圖4C）。與之形成鮮明對(duì)比的是，Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸黏液層厚度顯著減少，部分區(qū)域完全缺失黏液層（圖4C）。為量化比較黏液層厚度，我們測(cè)量了黏液總面積并將其與各小鼠結(jié)腸上皮周緣長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化。分析表明IEC特異性XBP1缺失導(dǎo)致整體黏液層厚度顯著減少（圖4D）。為評(píng)估Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸中細(xì)菌與上皮表面的分離是否受損，我們采用真細(xì)菌核糖體RNA特異性探針（EUB338）進(jìn)行熒光原位雜交（FISH），隨后利用荊豆凝集素I（UEA-I）對(duì)α-連接巖藻糖殘基進(jìn)行免疫熒光染色以顯示黏液層。對(duì)照組小鼠中細(xì)菌與結(jié)腸上皮明顯分離，而Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸中細(xì)菌侵入受損黏液層并與腸上皮細(xì)胞表面接觸（圖4E）。這些結(jié)果表明，IEC特異性XBP1缺失導(dǎo)致MUC2表達(dá)減少并損害保護(hù)性黏液層形成，使管腔細(xì)菌得以接觸結(jié)腸上皮。

圖4 IECs中XBP1表達(dá)調(diào)控結(jié)腸MUC2表達(dá)及黏液層形成

6．Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠出現(xiàn)細(xì)菌易位至結(jié)腸黏膜和全身性炎癥

   我們推測(cè)XBP1缺失引起的黏液層形成受損， combined with caspase-8缺失IECs壞死性凋亡所致上皮屏障破壞，可使細(xì)菌侵入黏膜和黏膜下層，導(dǎo)致Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠發(fā)生嚴(yán)重結(jié)腸炎。首先我們證實(shí)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠也表現(xiàn)出MUC2表達(dá)降低和總黏蛋白水平減少（圖5A）。與既往報(bào)道稱IEC特異性caspase-8缺失降低結(jié)腸MUC2表達(dá)相反，我們的RNA-seq、RT-qPCR分析、MUC2免疫染色及AB-PAS染色均未發(fā)現(xiàn)Casp8IEC-KO小鼠結(jié)腸MUC2表達(dá)或黏液水平較對(duì)照組降低（圖5A）。因此Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠結(jié)腸黏蛋白水平降低源于XBP1而非caspase-8缺失。為評(píng)估細(xì)菌向上皮下層易位情況，我們采用FISH技術(shù)對(duì)Casp8IEC-KO和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠瑞士卷結(jié)腸切片進(jìn)行細(xì)菌16s rRNA染色。果然，在幾乎所有Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（11只中10只）的黏膜下層檢測(cè)到細(xì)菌存在，而Casp8IEC-KO小鼠僅37.5%（24只中9只）出現(xiàn)此現(xiàn)象（圖5B）。此外，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠（而非Casp8IEC-KO小鼠）出現(xiàn)脾臟腫大和外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量增加（圖5C和5D），表明細(xì)菌向上皮下層易位引發(fā)了全身免疫激活。這些結(jié)果證明，IEC特異性XBP1與caspase-8聯(lián)合缺失導(dǎo)致細(xì)菌從管腔易位至結(jié)腸上皮下層并引發(fā)全身性炎癥。

圖5 上皮特異性XBP1抑制細(xì)菌易位并阻止Casp8IEC-KO小鼠全身性炎癥

7．抑制壞死性凋亡可阻止Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KO小鼠的細(xì)菌易位和全身性炎癥

   MUC2僅由結(jié)腸上皮杯狀細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。我們探究XBP1缺失是否可能誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞死亡，從而間接導(dǎo)致MUC2表達(dá)減少和黏液層受損。為此我們通過CC3免疫染色和TUNEL染色評(píng)估Xbp1IEC-KO與對(duì)照組小鼠結(jié)腸細(xì)胞死亡情況。未檢測(cè)到Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸死亡細(xì)胞數(shù)量增加，不支持XBP1缺失導(dǎo)致杯狀細(xì)胞死亡的假設(shè)。我們隨后檢驗(yàn)聯(lián)合抑制caspase-8誘導(dǎo)的凋亡和RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡能否挽救IEC特異性XBP1缺失導(dǎo)致的MUC2表達(dá)受損和黏液層形成障礙。我們對(duì)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結(jié)腸切片進(jìn)行MUC2免疫染色與AB-PAS染色，并對(duì)IECs中MUC2表達(dá)進(jìn)行免疫印跡分析。這些實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合抑制凋亡和壞死性凋亡未能挽救Xbp1IEC-KO小鼠的MUC2表達(dá)減少。此外，結(jié)腸橫截面黏液層可視化與量化顯示，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠的黏液層形成缺陷與Xbp1IEC-KO小鼠相似（圖6A和6B）。這些結(jié)果表明Xbp1IEC-KO小鼠黏蛋白水平降低和黏液層形成受損并非由杯狀細(xì)胞壞死性凋亡和/或凋亡增加引起。

圖6 上皮特異性XBP1以不依賴內(nèi)在凋亡和壞死性凋亡的方式調(diào)控Muc2表達(dá)

   我們隨后評(píng)估抑制壞死性凋亡能否阻止細(xì)菌侵入Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠黏膜和黏膜下層。與MUC2表達(dá)減少一致，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可侵入受損黏液層并抵達(dá)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結(jié)腸上皮表面（圖6A）。但結(jié)腸瑞士卷切片16s rRNA FISH染色顯示，細(xì)菌未浸潤(rùn)Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠結(jié)腸黏膜下層（圖6C）。與無細(xì)菌浸潤(rùn)一致，Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KORipk3?/?和Xbp1IEC-KOCasp8IEC-KOMlkl?/?小鼠未出現(xiàn)全身性炎癥跡象，表現(xiàn)為脾臟大小正常且外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量與同窩對(duì)照組相當(dāng)（圖6D）。這些結(jié)果表明，抑制壞死性凋亡雖不能挽救黏液層缺陷，但通過修復(fù)上皮屏障阻止了細(xì)菌向上皮下層浸潤(rùn)。

8．XBP1缺失以杯狀細(xì)胞內(nèi)在方式減少M(fèi)uc2表達(dá)

   腸道微生物群的存在與組成調(diào)節(jié)結(jié)腸MUC2產(chǎn)生及黏液層通透性和厚度。因此我們探究XBP1缺失是以細(xì)胞內(nèi)在方式還是通過影響微生物群等其他因素間接導(dǎo)致Muc2表達(dá)減少。為解答此問題，我們培養(yǎng)對(duì)照組和Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸類器官，并通過γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)誘導(dǎo)其分化為杯狀細(xì)胞（圖7A）。RT-qPCR分析顯示DAPT處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)對(duì)照組結(jié)腸類器官M(fèi)uc2表達(dá)，而Xbp1IEC-KO小鼠類器官中Muc2表達(dá)顯著降低（圖7B）。XBP1缺失不影響杯狀細(xì)胞分化，表現(xiàn)為對(duì)照組與XBP1缺失類器官中分泌細(xì)胞命運(yùn)決定關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（包括Atoh1（Math1）、Spdef和Klf4）表達(dá)水平相當(dāng)（圖7B）。這些發(fā)現(xiàn)與Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量未改變一致，且RNA-seq分析顯示Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞分化基因未減少（圖4A）。因此XBP1缺失以細(xì)胞內(nèi)在方式抑制杯狀細(xì)胞MUC2表達(dá)。

圖7 XBP1以杯狀細(xì)胞內(nèi)在方式調(diào)控Muc2表達(dá)

   IEC特異性XBP1缺失導(dǎo)致需肌醇酶1α（IRE1α）激活，表現(xiàn)為與對(duì)照組相比Xbp1IEC-KO小鼠結(jié)腸IECs中IRE1α磷酸化增加，這與既往報(bào)道一致。IRE1α自磷酸化誘導(dǎo)其核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的RNase活性，從而介導(dǎo)未剪接Xbp1（Xbp1u）的非經(jīng)典剪接，產(chǎn)生剪接型Xbp1（Xbp1s）。除Xbp1u的非經(jīng)典剪接外，IRE1α還能通過其核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域降解特定mRNA池，該過程稱為 regulated IRE1-dependent decay（RIDD）。因此我們推測(cè)Muc2可能是XBP1缺失杯狀細(xì)胞中活性IRE1α通過RIDD降解的靶標(biāo)。為驗(yàn)證該假設(shè)，我們用IRE1α高特異性激酶抑制劑G′9668處理對(duì)照組或Xbp1IEC-KO小鼠類器官（圖7C）。Cre介導(dǎo)的Xbp1基因loxP側(cè)翼外顯子2切除導(dǎo)致移碼突變并引入提前終止密碼子，使XBP1S蛋白表達(dá)缺失。由于外顯子2缺失后IRE1介導(dǎo)的剪接位點(diǎn)保留且XBP1S缺失誘導(dǎo)IRE1激活，我們可通過Xbp1剪接實(shí)驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組或Xbp1IEC-KO小鼠類器官中IRE1活性（圖7D）。RT-PCR檢測(cè)Xbp1u和Xbp1s顯示XBP1缺失類器官中Xbp1剪接增加，而IRE1激酶抑制劑G′9668可抑制此現(xiàn)象（圖7D）。但RT-qPCR分析表明缺失XBP1的杯狀細(xì)胞分化類器官中Muc2 mRNA表達(dá)在G′9668處理后未增加（圖7E）。除IRE1α外，黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IRE1旁系同源蛋白IRE1β（基因名ERN2）。IRE1β在杯狀細(xì)胞中高度富集，對(duì)維持黏膜穩(wěn)態(tài)起重要作用。與IRE1α相似，IRE1β含核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，可執(zhí)行Xbp1u的非經(jīng)典剪接。有觀點(diǎn)認(rèn)為IRE1β的核酸內(nèi)切酶活性可降解Muc2 mRNA并參與腸道黏蛋白穩(wěn)態(tài)。在Xbp1剪接實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)到IRE1α激酶抑制劑G′9668存在時(shí)仍有殘留Xbp1s條帶（圖7D）。因此我們探究XBP1缺失的杯狀細(xì)胞中IRE1β是否可能被激活并降解Muc2 mRNA。為此我們用IRE1核酸內(nèi)切酶抑制劑4μ8C（可抑制IRE1α和IRE1β的核酸內(nèi)切酶活性）處理杯狀細(xì)胞分化的對(duì)照組或Xbp1?/?類器官。確實(shí)，4μ8C處理抑制了IRE1激活（通過XBP1缺失類器官中Xbp1剪接檢測(cè)證實(shí)）（圖7D）。此外，4μ8C處理使Xbp1?/?類器官M(fèi)uc2 mRNA表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平（圖7E）。IRE1抑制不改變DAPT誘導(dǎo)的結(jié)腸類器官杯狀細(xì)胞分化。這些結(jié)果支持Muc2在缺失XBP1的杯狀細(xì)胞中被IRE1β降解。

   前梯度蛋白同源物2（AGR2）屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）家族，與炎癥性腸?。↖BD）存在關(guān)聯(lián)。Agr2?/?小鼠表現(xiàn)為上皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、隨年齡進(jìn)展的直腸脫垂，以及右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的急性重癥結(jié)腸炎易感性。AGR2在杯狀細(xì)胞中高度富集表達(dá)，其缺失會(huì)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞MUC2產(chǎn)生減少和結(jié)腸黏液層形成受損，表明AGR2在維持腸道上皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和MUC2生物合成中起關(guān)鍵作用。此外，研究提出XBP1可調(diào)控肺上皮細(xì)胞中Agr2表達(dá)。AGR2與IRE1β相互作用，阻止其激活以及IRE1β介導(dǎo)的Xbp1u剪接。因此我們推測(cè)XBP1缺陷的杯狀細(xì)胞可能表現(xiàn)出AGR2表達(dá)受損，導(dǎo)致IRE1β激活進(jìn)而引起Muc2 mRNA降解。確實(shí)，免疫印跡分析顯示與對(duì)照組相比，Xbp1IEC-KO小鼠IECs中AGR2表達(dá)減少（圖7F）。與此一致，缺失XBP1的杯狀細(xì)胞分化類器官中Agr2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低（圖7G）。雖然G′9668和4μ8C處理未改變Xbp1?/?類器官中Agr2表達(dá)，但抑制IRE1α激酶活性或IRE1α/IRE1β核酸內(nèi)切酶活性會(huì)降低對(duì)照組類器官的Agr2表達(dá)（圖7G），表明剪接型XBP1可誘導(dǎo)Agr2表達(dá)。與各自對(duì)照組相比，XBP1缺陷的IECs或Xbp1?/?類器官中IRE1β表達(dá)未受影響。為研究XBP1是否調(diào)控AGR2表達(dá)，我們采用衣霉素孵育類器官化學(xué)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（圖7H）。Xbp1u剪接增加以及Hspa5（免疫球蛋白結(jié)合蛋白[BiP]）mRNA表達(dá)升高證實(shí)衣霉素處理成功誘導(dǎo)類器官內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（圖7I和7J）。此外，RT-qPCR分析顯示對(duì)照組和XBP1缺陷類器官中Pdia6（激活轉(zhuǎn)錄因子6[ATF6]介導(dǎo)的UPR靶基因）被強(qiáng)烈誘導(dǎo)（圖7J）。但缺失XBP1的類器官未能上調(diào)兩個(gè)已知XBP1靶基因Dnajb9和Sec61a1的表達(dá)（圖7J）。而且與對(duì)照組類器官相反，衣霉素處理未能增加Xbp1?/?類器官中Agr2表達(dá)（圖7J）。這些結(jié)果表明XBP1通過誘導(dǎo)AGR2表達(dá)阻止IRE1β激活并抑制IRE1β介導(dǎo)的Muc2 mRNA降解。

結(jié)論

   我們的研究揭示了IECs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與壞死性凋亡調(diào)控之間存在重要交互作用，共同維持健康的免疫穩(wěn)態(tài)并預(yù)防腸道炎癥。這些發(fā)現(xiàn)暗示不同通路間的功能冗余可能是大多數(shù)IBD易感基因外顯率低的基礎(chǔ)，并表明可能需同時(shí)影響腸道屏障不同組分的聯(lián)合缺陷才能啟動(dòng)腸道炎癥并使其慢性化。

參考文獻(xiàn)：

Kaya GG, Schwarzer R, Dannappel M, Vlantis K, G?bel U, Kondylis V, Nedospasov SA, Pasparakis M. Unfolded protein response transcription factor XBP1 suppresses necroptosis-induced colitis by reinforcing the mucus barrier. Immunity. 2025 Aug 22:S1074-7613(25)00332-2. doi: 10.1016/j.immuni.2025.07.023. Epub ahead of print. PMID: 40865520.